Yeni yaklaşımın adı iDEMS (Kütle Spektrometresi için EdU etiketlemesi ile DNA izolasyonu).
Nature Cell Biology’de yakın zamanda yayınlanan bir teknik rapor, replikasyonu takiben DNA’daki spesifik değişiklikleri inceler. Bilim adamları, iDEMS (Kütle Spektrometresi için EdU etiketlemesi ile DNA izolasyonu) olarak bilinen kütle spektrometrisini kullanan oldukça hassas, nicel bir yöntem geliştirdiler.
“Çalışmamızdaki yenilik, yaygın olarak kullanılan sıralama yöntemlerini kullanmamamızdır. Groth laboratuvarından raporun ortak yazarlarından Dr. Stewart-Morgan, bu alanda bunun yerine kütle spektrometresini kullandık; Kopenhag Üniversitesi’ndeki Novo Nordisk Vakfı Protein Araştırma Merkezi’nde (CPR).
Bu benzersiz yaklaşım, MRC Londra Tıp Bilimleri Enstitüsü’ndeki (LMS) Hajkova laboratuvarıyla ortak bir projenin sonucudur. “Groth laboratuvarında replikasyon konusunda uzmanlığımız var ve Hajkova laboratuvarında kütle spektrometresi ile DNA metilasyonunu inceleme konusunda uzmanlığımız var. Bence bu multidisipliner işbirliği, projenin bu kadar başarılı olmasının büyük bir nedeni,” diye açıklıyor Dr. Stewart-Morgan. “iDEMS kullanarak yaptığımız araştırmanın sonuçları kesin ve gelecekteki araştırmalar için yeni yollar açıyor.”
DNA modifikasyonları ve hücre stabilitesi
Genom, bir hücrede bulunan tüm DNA talimatları setidir. Bir organizmadaki hemen hemen tüm hücreler aynı genetik bilgiyi içerir – ancak hangi genlerin ifade edildiği hücrenin işlevine bağlıdır. Bu hücreye özgü gen ifadesi, DNA’ya doğrudan kimyasal modifikasyonların yanı sıra DNA’ya bağlı proteinlerden oluşan hücrenin epigenomu tarafından düzenlenir. En önemli epigenetik düzenleyicilerden biri, genomun ifade edilmemesi gereken bölgelerini kapatan kimyasal bir belirteç olan DNA metilasyonudur. Bu belirteçlerin modeli, bir hücrenin stabilitesini ve kimliğini korumada çok önemlidir: örneğin, bir karaciğer hücresindeki DNA metilasyonu, bir kan hücresindeki DNA metilasyon modelinden farklı olacaktır.
Hücre bölünmesi sırasında DNA eşlendiğinde , DNA metilasyonu da dahil olmak üzere DNA ile ilişkili epigenetik işaretler seyreltilir. Yeni oluşturulan DNA sarmallarının, gen ifadesinin, genomik stabilitenin ve hücrenin kimliğinin epigenetik hafızasının kontrolünü sürdürmek için metilasyon düzeyini ve modelini yeniden oluşturması gerekir.
Ancak, bu süreç hakkında pek çok şey bilinmiyor, ve DNA metilasyonunun kaybı, çok proliferatif olan kanser hücreleri ve bir kişinin yaşamı boyunca birçok kez çoğalan yaşlı hücreler gibi birçok kez bölünen hücrelerde yaygın bir özelliktir. Son yıllarda birkaç grup, sıralama yöntemlerini kullanarak bu süreci araştırmaya çalıştı, ancak replikatif metilasyon sonrası bakımın tam kinetiği belirsizliğini koruyor.
Metilasyonu yeniden tesis etme
Araştırmacılar, iDEMS kullanarak DNA metilasyon seviyelerinin replikasyondan sonra istikrarlı bir şekilde arttığını ve 4 saat sonra replike edilmiş DNA ve genomik DNA’daki seviyelerin eşit olduğunu buldu. Bu, bu sürecin sabit ve yavaş bir hızda ilerlediğini gösterir. Bununla birlikte, hücre bölünmesi tarafından geride bırakılır.
“Zamanla hücrelerin, replikasyondan sonra metilasyonlarını yeniden oluşturmak için yeterince uzun süreleri kalmaz ve genomun metilasyonu sonunda seyrelir. Bu, metilasyonun yeniden kurulması için ilk kez çok net kinetiklerin gösterilmesidir. Ayrıca, hangi metilasyon işaretlerinin yeni kurulduğunu ayırt etmemizi sağlayan DNA metilasyon seviyelerinin mutlak miktarını gördük. Bu, kinetik ölçümlerimizde bize güven verdi,” diyor Dr. Stewart-Morgan.
İkinci bir kimyasal belirteç
Araştırmacılar, ikinci bir belirteç olan DNA hidroksimetilasyonu incelemek için iDEMS’yi de kullandılar. metilasyondan çok daha nadir genomik belirteç. Dr Stewart-Morgan, sonuçlarının daha önceki araştırmaları doğruladığını söylüyor: “Bir DNA sarmalının, şablon veya ‘ebeveyn’ sarmalın her zaman diğer ‘yavru’ sarmaldan daha fazla hidroksimetilasyona sahip olduğunu bulduk ve bu işaretçinin DNA’yı ayırt ettiğini gösteren daha önceki çalışmaları destekliyoruz.
“Bununla birlikte, hücre döngüsü boyunca ebeveyn ve yavru sarmallar arasında hidroksimetilasyon düzeylerinin eşit olduğu hiçbir nokta olmadığını da keşfettik. Bu, iplikçikler arasındaki bu farkın, örneğin DNA onarımı sırasında hücreler tarafından nasıl kullanılabileceği konusunda yeni soruları gündeme getiriyor.”
iDEMS’nin potansiyeli
iDEMS, kopyalanmış DNA üzerindeki DNA değişikliklerini doğrudan ölçerek şu sorunları çözer: DNA replikasyonunu takiben DNA metilasyonu ve hidroksimetilasyon kinetiği. Dr. Stewart-Morgan, “iDEMS, epigenom bakımı ve DNA modifikasyonu biyolojisindeki önemli soruları ele almak için dinamik ve bilgilendirici bir araçtır” diyor.
Geleceğe bakıldığında, iDEMS, metilasyon ve hidroksimetilasyon dinamiklerinin profilini çıkarmada faydalı olacaktır. yaşlanma ve kanser evrimi dahil olmak üzere farklı hücresel bağlamlar. Sıralama verileriyle karşılaştırıldığında, kütle spektrometresi basit, hızlı bir okuma sağlar ve bu nedenle iDEMS, tıbbi ortamlar ve ilaç keşif çalışmaları gibi verimliliğin önemli olduğu yerlerde yararlı olabilir.
“Sonuçlarımız, yeni yöntemlerin ne kadar önemli olduğunun altını çiziyor. biyolojiyi birden fazla mercekten anlamak için. iDEMS, epigenomu incelemek için moleküler biyolojide kullanılan diğer yerleşik yöntemlerle birleştirilebildiği için son derece esnektir. Bu nedenle, bu yöntem, epigenom stabilitesini araştıran teknoloji grubuna önemli bir araç ekliyor,” diye bitiriyor Dr. Stewart-Morgan.
Referans: “DNA metilasyonu ve hidroksimetilasyonun iDEMS ile miktarının belirlenmesi”, Kathleen R. Stewart -Morgan, Cristina E. Requena, Valentin Flury, Qian Du, Zoe Heckhausen, Petra Hajkova ve Anja Groth, 12 Ocak 2023, Nature Cell Biology.
DOI: 10.1038/s41556-022-01048-x{11